[GUIDA] - Coltura su agar e piastre di Petri

Guida completa per clonare, isolare e mantenere ceppi di funghi

Immagina di poter “mettere in pausa” un fungo, sezionarlo in due dimensioni, guardare chi lo sta attaccando, salvare solo la parte sana e moltiplicarla a piacere. Questo è, in pratica, ciò che permette la coltura su agar con piastre di Petri: il cuore del lavoro serio sul micelio.

In questa guida vediamo tutto il ciclo: cos’è l’agar, come prepararlo, come versarlo, come clonare un fungo, come riconoscere e gestire le contaminazioni, e come passare da una piastra pulita allo spawn.

1. Cosa sono agar e piastre di Petri

1.1. Cos’è l’agar agar

L’agar agar è un gelificante di origine vegetale, ricavato da alghe rosse. In polvere si presenta come una farina bianca o crema molto fine. A differenza della gelatina animale, è termostabile: solidifica quando si raffredda, ma non si scioglie alle normali temperature di incubazione del micelio.

In coltivazione fungina, l’agar è la base per creare una gelatina nutritiva dove far crescere micelio in modo controllato, in 2D: quello che vedi è sostanzialmente una “mappa” di cosa sta succedendo sulla superficie.

1.2. Le piastre di Petri

Le piastre di Petri (capsule Petri) sono dischi piatti, sterili, in plastica o vetro, dove viene versato l’agar caldo sterilizzato. Raffreddandosi, si solidifica in uno strato uniforme.

Perché usare agar invece di coltura liquida:

• Controllo delle contaminazioni:
  su agar vedi distintamente micelio, muffe, batteri, lieviti.

• Possibilità di “salvataggio”:
  se una piastra è contaminata, puoi prelevare una zona pulita di micelio e trasferirla.

• Clonazione più semplice:
  dal tessuto di fungo ottieni micelio visibile e isolabile.

• Isolamento di ceppi da spore:
  indispensabile se vuoi selezionare ceppi da spore o da ambienti sporchi.

Con la coltura liquida lavori in 3D: ciò che succede nel volume non lo vedi bene. Con agar lavori in 2D: tutto è visibile in superficie.

2. Ricette pratiche per agar nutriente

Esistono decine di ricette. Qui restiamo sulle più collaudate.

2.1. PDYA – Potato Dextrose Yeast Agar

È una variante del classico PDA (Potato Dextrose Agar) con aggiunta di lievito di birra per migliorare la crescita.

Dosi per ~20 piastre da 90 mm:

• Acqua: 600 ml in partenza, filtrata poi a 500–550 ml

• Patate: 150 g (sbucciate, a cubetti)

• Zucchero (destrosio o zucchero da cucina): 5 g

• Agar agar in polvere: 8 g

• Lievito di birra secco: 1 g (non lievito istantaneo per dolci)

Perché 600 ml e non 500:
durante la bollitura delle patate una parte d’acqua evapora; meglio partire un po’ abbondanti e poi riportare il volume a 500–550 ml filtrando.

2.2. MEYA – Malt Extract Yeast Agar

Analogo, ma con estratto di malto al posto del brodo di patate.

Schema tipico (per 1 L):

• Acqua: 1 L

• Estratto di malto: 20 g

• Agar agar: 15–20 g

• Lievito di birra secco: 1–2 g

È più rapido da preparare perché evita la prebollitura delle patate.

2.3. Principio chiave

Troppi nutrienti rendono il micelio “pigro” e slow. Un terreno moderatamente ricco spinge il micelio a crescere veloce “in cerca di cibo”, e quindi colonizza le piastre più rapidamente, superando competitori lenti.

3. Preparare l’agar passo per passo

Prendiamo come esempio la PDYA, che hai già nei file.

3.1. Preparare il brodo di patate

1. Sbucciare le patate:

   • Quantità: 150 g

   • Tagliarle a cubetti piccoli per una cottura uniforme.

2. Bollitura:

   • Mettere le patate in una pentola con 600 ml di acqua.

   • Sobbollire per 30 minuti.

3. Filtrare il brodo:

   • Filtrare con colino pulito o tessuto sterile.

   • Controllare il volume: riportare a 500–550 ml se necessario (aggiungendo acqua sterile o bollita).

3.2. Aggiungere gli altri componenti

1. Trasferimento in barattolo:

   • Versare il brodo in un barattolo/bottiglia di vetro spesso, adatto alla pentola a pressione.

2. Aggiunta zucchero:

   • Aggiungere 5 g di zucchero e mescolare.

   • Se il liquido è freddo, scaldarlo un po’ (microonde o bagnomaria) per facilitare la dissoluzione dell’agar.

3. Pesare e aggiungere agar e lievito:

   • Pesare 8 g di agar (puoi variare tra 7,5 e 10 g a seconda della consistenza desiderata).

   • Pesare 1 g di lievito di birra (non chimico per dolci).

   • Aggiungere entrambi al brodo caldo e mescolare rapidamente fino a dispersione.

4. Fase contenitore:

   • Trasferire il tutto in una bottiglia di vetro spesso (tipo siero o bottiglia da laboratorio), oppure in un barattolo alto.

   • Deve esserci abbastanza spazio vuoto perché l’agar durante la sterilizzazione bolle in modo violento.

3.3. Preparare il tappo per la sterilizzazione

1. Filtro sul collo:

   • Mettere una pallina di polyfill (lana sintetica) o altro filtro sul collo della bottiglia.

   • Serve per lo scambio d’aria durante la sterilizzazione ed evita esplosioni.

2. Stagnola:

   • Coprire il tutto con un foglio di carta stagnola per proteggere da gocce e contaminazioni.

Ora il “brodo agar” è pronto per entrare in pentola a pressione.

4. Sterilizzazione dell’agar

4.1. In pentola a pressione

1. Posizionamento:

   • Mettere la bottiglia in pentola a pressione, su un rialzo o panno per evitare il contatto diretto col fondo metallico.

2. Acqua nella pentola:

   • Aggiungere acqua fino a qualche centimetro sotto il livello del fondo della bottiglia.

3. Parametri:

   • Pressione: anche 10 psi vanno bene (meno turbolenza, meno rischio di traboccamenti); se lavori a 15 psi, controlla che la pentola non sfiati troppo.

   • Tempo: 30–45 minuti dall’entrata effettiva in pressione.

4. Raffreddamento:

   • Spegnere il fuoco e non forzare la valvola.

   • Lasciare scendere la pressione da sola.

   • Aprire la pentola solo quando il manometro è a zero e non c’è più vapore in uscita.

   • Estrarre la bottiglia con presina/guanti resistenti al calore.

4.2. Nota importante

Se apri la pentola troppo presto o scarichi la pressione di colpo, la differenza di pressione può far traboccare l’agar fuori dalla bottiglia.

5. Versare l’agar nelle piastre di Petri

Questa fase è cruciale: si gioca tutto sulla sterilità e sulla condensa.

5.1. Preparazione dello spazio di lavoro

• Cappa a flusso laminare:
  pulire il piano con alcool, accendere, lasciare che il flusso stabilizzi l’aria.

• Glove-box:
  pulire internamente con alcool; evitare di inserire la bottiglia ancora bollente per non creare condensa esagerata.

Suggerimenti:

• Guanti: meglio usarli; disinfettarli con alcool.

• Ambiente: niente correnti d’aria, niente persone che girano; meno turbolenze, meglio è.

5.2. Temperatura di colata

Qui molti sbagliano.

• La bottiglia deve essere calda ma maneggiabile a mani nude.

• Se versi agar troppo caldo: tanta condensa nelle piastre.

• Se versi troppo freddo: rischi che l’agar gelifichi nella bottiglia prima di finire.

Indicativamente: dopo la sterilizzazione, lascia la bottiglia a temperatura ambiente o davanti alla cappa per 25–40 minuti finché la senti calda ma non ustionante.

5.3. Procedura di versata

1. Portare tutto in area sterile:

   • Bottiglia con agar

   • Confezione di piastre Petri sterili

2. Aprire la confezione di piastre:

   • Aprire solo quanto basta per estrarre una pila (di solito 10–20 pezzi).

   • Tenere le piastre sempre chiuse finché non versi.

3. Versare l’agar:

   • Prendere una piastra, sollevare appena il coperchio senza staccarlo del tutto, versare circa 20–25 ml di agar (copertura uniforme del fondo).

   • Richiudere subito.

   • Procedere piastra dopo piastra.

4. Lasciare solidificare:

   • Impilare le piastre in colonne (es. 10 per pila).

   • Lasciarle in area pulita finché la gelatina si è solidificata completamente.

5.4. Sigillare le piastre

Una volta solidificato l’agar, bisogna sigillare le piastre per ridurre le contaminazioni.

Opzione 1 – Pellicola alimentare:

• Tagliare strisce di pellicola.

• Avvolgere ogni pila di piastre (o ogni singola piastra) con la pellicola.

Opzione 2 – Parafilm:

• Pellicola specifica per laboratorio: elastica, impermeabile, ma permeabile ai gas.

• Costa di più, ma un rotolo dura tantissimo.

• Si avvolge a nastro lungo il bordo della piastra.

Le piastre non inoculate, una volta sigillate, possono essere conservate:

• a temperatura ambiente per 1–2 mesi,

• in frigo per periodi più lunghi (meglio usare contenitori chiusi e asciutti).

6. Clonare un fungo con agar e Petri

Ora entra in gioco la parte divertente: trasformare un fungo in micelio puro.

6.1. Idea di base

Il principio è lo stesso della clonazione in coltura liquida: prelevare un frammento di tessuto interno (pulito) del fungo e posarlo sull’agar. Da quel frammento, se tutto va bene, il micelio ricresce e comincia ad invadere la piastra.

La differenza è che su piastra:

• vedi micelio e contaminazioni separatamente,

• puoi fare trasferimenti: spostare solo la parte di micelio sano su un’altra piastra pulita.

6.2. Preparazione

Attrezzatura:

• Piastre di Petri con agar pronto

• Bisturi o scalpel sterilizzabile

• Pinzette (opzionali)

• Funghi freschi (meglio coltivati, più puliti)

• Cappa o glove box

• Alcool / acqua ossigenata

• Guanti

Pulizia:

• Lavare bene le mani o usare guanti disinfettati.

• Pulire il piano di lavoro.

• Funghi: l’esterno può essere sporco; il tessuto interno è la parte che ci interessa.

6.3. Prelevare il tessuto interno

1. Spezzare il fungo:

   • Non tagliare subito col bisturi.

   • Spezzare il fungo a mano a metà, così la parte interna non viene toccata da lame contaminate.

2. Se il fungo è duro/elastico (es. Pleurotus ostreatus adulto):

   • Incidere leggermente solo la superficie esterna con il bisturi.

   • Finire di spezzare con le mani.

   • Prelevare il frammento dalla parte centrale che non ha toccato la lama.

3. Pulizia preliminare:

   • Se necessario, tamponare la superficie esterna del fungo con carta/ovatta imbevuta in alcool o acqua ossigenata, prima di spezzarlo.

6.4. Inoculare le piastre

1. Sterilizzare il bisturi:

   • Passare la lama nella fiamma fino a incandescenza.

   • Lasciar raffreddare qualche secondo (evita di bruciare il tessuto).

2. Prelevare il frammento:

   • Scoprire rapidamente la piastra con il fungo (non quella con agar!).

   • Prelevare un piccolo cubetto di tessuto dalla parte interna con il bisturi.

3. Posare sull’agar:

   • Aprire una piastra di agar in area sterile.

   • Depositare il frammento al centro o in uno dei settori della piastra.

   • Richiudere subito.

4. Ripetere:

   • È buona pratica posare più frammenti per ogni piastra (es. 3–4), aumentando le probabilità che almeno uno sia pulito.

5. Sigillo:

• Sigillare le piastre con Parafilm

7. Incubazione delle piastre

Una volta sigillate, le piastre devono essere lasciate lavorare.

Temperatura ideale

20–22 °C
È la fascia in cui la maggior parte delle specie commestibili cresce in modo costante e prevedibile.

Luce o buio?

Meglio buio o penombra.
La luce non è un problema per il micelio, ma può stimolare la formazione di primordi in alcune specie, cosa che non vogliamo in questa fase.

Posizione

Durante l’incubazione, le piastre vanno tenute capovolte (coperchio sotto, agar sopra).
Questo riduce drasticamente la formazione di condensa che, se cade sul gel, può:

• far “nuotare” i frammenti di tessuto

• rallentare la crescita

• favorire contaminazioni batteriche

8. Cosa aspettarsi nei primi giorni

8.1. Crescita del micelio

Se il tessuto era sano e la tecnica sterile, nel giro di 2–7 giorni vedrai:

• una peluria bianca che parte dal frammento

• un’espansione radiale, uniforme, simile a una macchia circolare

Ogni specie ha un suo stile di crescita:

• Pleurotus → crescita veloce, micelio “a ragnatela”

• Pioppino (Agrocybe) → crescita più compatta

• Shiitake → crescita lenta, micelio spesso cotonoso

• Cardoncello → crescita iniziale lenta, poi accelera

8.2. Contaminazioni: come riconoscerle

È normale che compaiano, soprattutto se il fungo era selvatico.

Muffe

• Aspetto peloso

• Colori: verde, nero, rosa, giallo

• Crescita molto rapida

• Spesso partono da un punto lontano dal tessuto

Batteri

• Chiazze lucide, viscide

• Odore sgradevole (se apri la piastra, cosa da evitare)

• Crescita esplosiva in 24–48 ore

Lieviti

• Macchie opache, tonde

• Crescita lenta

• Spesso inglobati dal micelio aggressivo

9. Come “salvare” una piastra contaminata

Questa è la vera forza dell’agar: puoi recuperare il micelio sano.

Procedura di trasferimento (subculturing)

1. Preparare una nuova piastra sterile

2. Sterilizzare il bisturi nella fiamma

3. Aprire la piastra contaminata il minimo indispensabile

4. Prelevare un triangolino di micelio dalla zona più lontana dalla contaminazione

5. Depositare il frammento sulla nuova piastra

6. Sigillare e incubare

Se il micelio è vigoroso, spesso supera la contaminazione e riparte pulito.

10. Quando una piastra è “pronta”

Una piastra è considerata pronta quando:

• il micelio ha colonizzato tutta la superficie

• non sono presenti contaminazioni

• la crescita è uniforme e compatta

• il bordo della colonia è regolare

A questo punto la piastra può essere:

• usata per inoculare grain spawn

• clonata su altre piastre

• conservata in frigorifero

11. Conservazione a lungo termine

Durante la crescita

Le piastre vanno tenute capovolte a temperatura ambiente.

Una volta mature

Si conservano in frigorifero, ma:

• non capovolte (altrimenti la condensa cade sull’agar)

• dentro contenitori ermetici

• con sacchetti di essiccante per ridurre l’umidità

Una piastra ben sigillata può durare anche un anno.

12. Dalla piastra allo spawn

Quando hai una piastra pulita, puoi usarla per inoculare i cereali sterilizzati.

Procedura

1. Preparare un barattolo di grain spawn sterilizzato

2. Lavorare in glove box o cappa

3. Sterilizzare il bisturi

4. Tagliare un triangolino di agar colonizzato

5. Aprire il barattolo, inserire il triangolino, richiudere subito

6. Agitare leggermente per far aderire il micelio ai chicchi

In pochi giorni vedrai i primi punti bianchi sui cereali.

13. Errori comuni e come evitarli

Troppa condensa

• Agar versato troppo caldo

• Piastre non capovolte durante incubazione

Crescita lenta

• Temperatura troppo bassa

• Terreno troppo ricco

• Tessuto vecchio o danneggiato dal calore

Contaminazioni frequenti

• Glove box troppo piccola o appannata

• Mani o guanti non disinfettati

• Troppi movimenti d’aria

• Tessuto prelevato dalla parte esterna del fungo

14. Perché l’agar è indispensabile in un laboratorio micologico

Chi coltiva funghi seriamente usa l’agar per:

• clonare ceppi vigorosi

• isolare micelio pulito da funghi selvatici

• selezionare ceppi più produttivi

• conservare ceppi per anni

• verificare la purezza di una coltura liquida

• testare la vitalità del micelio prima di inoculare grandi quantità di substrato

È la base di tutto il lavoro “di laboratorio” nella coltivazione dei funghi.